服務介紹

RNA作為生物體內的遺傳信息載體，根據結構和功能的不同分為信使RNA（Messenger RNA，mRNA）和非編碼（Non-coding RNA，ncRNA），在基因調控層面，這些RNA分子起到了至關重要的作用。

吉賽生物研發的第五代RNA過表達載體可對mRNA/lncRNA/circRNA分子實現精準表達，能滿足普通真核表達、慢病毒包裝和腺相關病毒（AAV）包裝和Fluc熒光檢測等多種用途。其中circRNA載體均攜帶優化過的側翼成環框架，含有精心改造的Alu元件、QKI等RBP的結合位點，并使用全新設計的環化介導序列，使插入的circRNA準確高效環化，mRNA及lncRNA表達載體攜帶強啟動子及KOZAK序列，使mRNA/lncRNA精準正確表達。

技術優勢

1. 過表達效率高；

2. 特異性強、準確率高：優化篩選過的表達元件有效保證目標RNA分子的序列準確表達；

3. 穩定性高：mRNA、lncRNA（100-3000nt序列）；circRNA（200-2500nt序列）均能實現準確高效過表達；

4. 適用范圍廣：可用于細胞轉染、包裝慢病毒或腺相關病毒，同時可提供GFP綠色熒光蛋白標記和嘌呤霉素抗性基因標記，適用于客戶不同的實驗需求。

服務流程

1. 載體構建；

2. 瞬時轉染；

3. 特異性引物設計合成；

4. RT-qPCR驗證；

5. Sanger測序驗證；

6. 病毒包裝（可選，列于病毒包裝項目）

客戶提供

1. 基因ID/物種/全長序列

2. 載體名稱

我們提供

1. 目的載體：10μg質粒+200μL甘油菌/對照載體：10μg質粒+200μL甘油菌；

2. 載體構建與驗證實驗報告：

①　載體構建步驟；

②　載體測序驗證結果原始文件；

③　細胞轉染實驗步驟；

④　qPCR實驗流程方案及產物測序；

⑤　載體構建與驗證實驗報告。

qRT-PCR檢測

圖1 hsa_circ_00AAAAA的相對表達差異

qPCR產物測序結果：

注：hsa_circ_00AAAAA在circBase中的環化位點序列GATTATGGAAACAGCTTTTTATAACTATGATG

結論：

相比于對照組，CAAAAA組的過表達倍數為***；PCR產物測序峰圖正常，無雜峰或疊帶，序列與環化位點參考序列對比吻合。以上結果表明CAAAAA能在真核細胞中成功過表達目的hsa_circ_00AAAAA。

1. circRNA過表達怎么做？

CircRNA的形成和線性RNA不同，因此對circRNA的過表達不能直接將序列連接到常規的真核表達載體（如pcDNA3.1）來進行。已明確的circRNA形成依賴于側翼序列中的反向互補序列（RCMs，如Alu元件）或與能調控circRNA生成的蛋白（如QKI）的結合位點，因此構建載體時可以在circRNA序列上下游分別增加一段反向互補的序列，質粒轉染細胞后會先轉錄出上游+circRNA+下游的線性RNA鏈，再依靠長下游的反向互補配對促使成環。

2. circRNA過表達成功標準？

載體構建好后瞬時轉染細胞進行RT-PCR檢測以驗證過表達效率。

1）qPCR檢測有過表達倍數，質粒瞬轉效率高，基因本底豐度不太高的話一般都可以過表達50倍以上；

2）使用Divergent引物檢測過表達的PCR產物是大小正確的單一條帶，PCR產物進行sanger測序確定成環序列準確。滿足這兩個條件才可以認為載體實現了對circRNA的準確高效率過表達。